Посадочный материал голубики. Размножение растений в пробирках ин-витро (in-vitro), укоренение, адаптация, время, раствор Растения инвитро

В отдаленной гибридизации находят применение такие методы культуры изолированных тканей, как оплодотворение in vitro, эмбриокультура (выращивание изолированных зародышей на искусственных питательных средах), клональное микроразмножение ценных гибридов, а также получение гаплоидов in vitro и криосохранение.

Оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости) проводится в том случае, когда невозможно осуществить оплодотворение между выбранными парами в естественных условиях. Это вызвано несколькими причинами: 1) физиологические (несоответствие во времени созревания пыльцы и т.д.); 2) морфологические (короткая пыльцевая трубка или блокирование роста ее на разных этапах развития и т.д.). Оплодотворение in vitro можно осуществить двумя способами: а) культивирование на искусственной агаризованной питательной среде завязи с нанесенной на нее готовой пыльцой; б) завязь вскрывается и на питательную среду переносятся кусочки плаценты с семяпочками, вблизи которых или непосредственно на ткани плаценты культивируется готовая пыльца. Визуально определить, прошло оплодотворение in vitro или нет, можно по быстроувеличивающимся в размерах семяпочкам. Сформировавшийся зародыш, как правило, не переходит в состояние покоя, а сразу прорастает и дает начало гибридному поколению. Плацентарное оплодотворение in vitro позволило преодолеть несовместимость в скрещивании сортов культурного табака N. tabacum с дикими видами N. rosulata и N. debneyi и сделало возможным получение межвидовых гибридов табака в опытах М. Ф. Терновского и др. (1976), Шинкаревой (1986).

Преодоление постгамной несовместимости. Постгамная несовместимость при отдаленной гибридизации возникает после оплодотворения. Часто при этом образуются щуплые невсхожие семена. Причиной может быть расхождение во времени развития зародыша и эндосперма. Из-за слабого развития эндосперма зародыш бывает неспособен к нормальному прорастанию. В таких случаях из зрелой щуплой зерновки изолируют зародыш и выращивают его в питательной среде.

Выращивание зародышей в искусственной питательной среде называется эмбриокультурой. Среда для выращивания зрелого зародыша может быть простой, без добавок физиологичеки активных веществ (например, среда Уайта) или любая другая, содержащая минеральные соли и сахарозу. При более отдаленных скрещиваниях нарушения в развитии зародыша могут наблюдаться уже на ранних этапах, что выражается в отсутствии дифференцировки, замедленном росте. В этом случае культура зародыша состоит из двух этапов – эмбрионального роста зародыша, во время которого продолжается его дифференцировка, и прорастания подросшего зародыша. Для первого этапа требуется более сложная по составу среда с повышенным содержанием сахарозы, с добавками различных аминокислот, витаминов и гормонов.

Применение эмбриокультуры в селекции приобретает в последнее время большое значение для получения отдаленных гибридов зерновых, злаковых и других сельскохозяйственных культур. Показана возможность увеличения выхода пшенично-ржаных гибридов путем доращивания незрелых зародышей, а также использования эмбриокультуры для преодоления постгамной несовместимости при гибридизации пшеницы с колосняком.

Метод эмбриокультуры находит все более широкое применение в межвидовой гибридизации овощных растений. Для лука разработаны приемы выращивания in vitro абортивных зародышей от гибридных семян с разных этапов эмбриогенеза, выращивание зародышей от частично фертильных межвидовых гибридов. Культура изолированных зародышей используется в селекции томатов и других овощных растений.

Исследована гормональная регуляция роста и развития зародышей томата in vitro. Обсуждается возможность применения эмбриокультуры для получения отдаленных гибридов подсолнечника, изучаются факторы, контролирующие рост и развитие in vitro зародышей подсолнечника, выделенных в разные сроки после опыления.

Культура изолированных зародышей как вспомогательный метод при отдаленной гибридизации применяется не только для преодоления постгамной несовместимости, но также с целью микроразмножения ценных гибридов. В этом случае микроразмножение идет путем каллусогенеза, индукции морфогенеза и получения растений-регенерантов из каллусной ткани. Техника клонирования незрелых зародышей позволяет размножать ценные генотипы растений на ранних стадиях жизненного цикла. Еще одна возможность применения культуры зародышей–использование ее в клеточной селекции.

Клональное микроразмножение отдаленных гибридов. Эмбриокультура дает возможность вырастить гибридные растения из неполноценных зародышей. Однако выход гибридных растений мал, и гибриды часто бывают стерильны. Иногда, например, при селекции гречихи, трудно воспроизвести в потомстве уникальные генотипы из-за перекрестного опыления культуры. Поэтому перед исследователями часто встает задача – размножить и сохранить полученные растения. В этом помогает метод клонального микроразмножения. Размножают гибриды путем активации развития меристемы пазушных почек (черенкованием стерильных побегов), адвентивными почками или регенерацией растений из каллусной ткани, в частности полученной при культивировании зародышей.

Получение гаплоидов in vitro и использование их в селекции. Роль гаплоидных растений в селекции очень велика. Применение их позволяет быстрее найти нужную комбинацию, сокращает время для создания сорта. Гаплоиды используются для получения стабильных гомозиготных линий. Для мутагенеза также удобнее использовать гаплоиды, поскольку на гаплоидном уровне облегчается отбор рецессивных мутаций.

В диплоидных растениях мутации редко затрагивают оба аллельных гена в гомологичных хромосомах. Особь обычно гетерозиготна (два гена различаются), при этом проявляется действие только доминантного (но не рецессивного) гена. Поскольку мутации чаще рецессивны, чем доминантны, их довольно сложно выявить. В гаплоидных же растениях, которые содержат только одну из каждой пары гомологичных хромосом, мутации проявляются немедленно. Селекция на гаплоидном уровне позволяет вести прямой отбор не только доминантных, но и рецессивных признаков.

Гаплоидные особи стерильны, но можно искусственно удвоить набор их хромосом с помощью колхицина и получить диплоидные гомозиготные растения.

Гаплоиды могут возникать спонтанно, но частота их спонтанного возникновения очень мала. Искусственным путем с Использованием методов in vitro удается получить большие количества гаплоидных растений. Существует три способа получения гаплоидов с использованием метода культуры изолированных тканей:

андрогенез – получение гаплоидных растений на искусственной питательной среде из изолированных пыльников и микроспор.

гиногенез – получение гаплоидных растений на искусственной питательной среде из изолированных семяпочек;

партеногенез – получение гаплоидов из гибридного зародыша, у которого из-за несовместимости хромосом родителей потеряны отцовские хромосомы.

Образовавшиеся в результате элиминации хромосом отцовского генома гаплоидные эмбриоиды культивируют на искусственных питательных средах и получают гаплоидные растения. Сорта ячменя Исток и Одесская-15 были получены комбинацией партеногенетического метода с культурой изолированных зародышей за четыре года вместо обычных 10–12 лет. Методом культуры пыльников из сортов и гибридов мягкой и твердой пшеницы в НПО «Элита Поволжья» за четыре года получено более 2,5 тыс. дигаплоидных линий, которые характеризуются гомогенностью и стабильностью.

Продолжается разработка технологии получения гаплоидов посредством культуры пыльников пшеницы, ячменя, кукурузы, озимой ржи, картофеля. В культуре пыльников возможны два пути образования гаплоидных растений. Первый – образование растений путем эмбриогенеза в пыльцевых зернах. При этом внутри пыльников из отдельных пыльцевых зерен возникают эмбриоиды. Они прорастают и дают гаплоидные растения. Второй – образование каллуса из клеток пыльника. В дальнейшем в результате морфогенеза из каллусных клеток регенерируют растения. В этом случае образовавшиеся растения не всегда бывают гаплоидными и часто отличаются по плоидности. До конца не выяснено, образуются ли они от полиплоидизированных гаплоидных клеток или от слившихся клеток.

Гаплоиды, полученные in vitro, могут применяться не только в практической селекции, но и в работах по генетической инженерии, а также по клеточной селекции. Пыльцевые зерна являются в некоторых случаях более удобными, чем протопласты, объектами для опытов по генетической трансформации.

Криосохранение растений

Криосохранение соматических клеток растений в жидком азоте (температура – 196° С) – новое направление в биотехнологии, которое широко стало развиваться с начала 70-х годов XX столетия. Цель данной технологии заключается в сохранении в культуре in vitro генофонда, а также в обеспечении селекционеров в любое время генотипом, имеющим искомые признаки: необходимая пыльца для проведения гибридизации; уникальные и единичные семена, в том числе не выносящие обезвоживания; трансформированные, мутантные, гибридные клетки разных видов растений, способных к морфогенезу in vitro; зиготические и соматические зародыши и т.д. В настоящее время разработаны условия криосохранения для культивируемых клеток более 30 видов, каллусных культур (около 10 видов), изолированных протопластов (8 видов), сохранения меристем (25 видов) и кончиков стебля (13 видов). Приоритет в этом направлении принадлежит Институту физиологии растений РАН и, в частности, отделу культуры тканей и морфогенеза, возглавляемому проф. Р. Г. Бутенко.

При проведении работ по криосохранению необходимо, прежде всего, учитывать специфику растительных клеток: отбирать мелкие клетки, с маленькой вакуолью и пониженным содержанием воды; разрабатывать в каждом отдельном случае подходы замораживания и последующего оттаивания растительных клеток. При криосохранении встречается ряд трудностей, одна из которых связана с защитой замораживаемых клеток и тканей от осмотического стресса и механического разрушения структур в результате образования и роста кристаллов льда внутри клетки. Одновременно с этим необходимо правильно подбирать условия, обеспечивающие высокую выживаемость клеток при оттаивании и рекультивации.

Несмотря на многообразие работ в этом направлении, в них все же наметились общие приемы, лежащие в основе криосохранения: обработка клеток перед замораживанием, применение криопротекторов, соблюдение определенного режима замораживания в интервале от 0 до –40° С (в редких случаях до -70° С), а также специальные предосторожности при оттаивании объектов.

Процесс криоконсервации, как правило, начинается с подготовки культуры клеток к замораживанию. Это может быть достигнуто несколькими способами, предусматривающими культивирование клеток на питательных средах, содержащих различные осмотически активные вещества: маннит или сорбит в концентрации 2–6%, аминокислоты и среди них, в первую очередь, пролин, чье значение для связывания воды в клетках растений широко известно, а также у-аминомасляная кислота.

Подбор криопротекторов, веществ, уменьшающих повреждение клеток от осмотического и механического стресса, проводят эмпирически по принципу наименьшей токсичности и оптимального эффекта. Среди всех известных криопротекторов выделяются такие легко проникающие в клетки вещества, как диметилсульфоксид (ДМСО, 5–10%), глицерин (10–20%), а также непроникающие высокомолекулярные–поливинилпиролидон (ПВП), декстран, полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой 6000.

Большое значение при криосохранении имеет правильно подобранный режим замораживания от 0 до –40° С. Как правило, для всех объектов устанавливается скорость замораживания 0,5–1 °С в минуту и всю эту работу проводят на специальном оборудовании, обеспечивающем программное замораживание. Такие приборы выпускает специальное конструкторское технологическое бюро с опытным производством при Институте проблем криобиологии и криомедицины (г. Харьков).

Таким образом, медленное замораживание и использование криопротекторов позволяет освободить клетку от свободной воды, и при –40° С клетки становятся полностью обезвоженными, что дает возможность проводить дальнейшее замораживание, а именно погружать ампулы с растительным материалом в жидкий азот.

Хранение материала в жидком азоте практически не лимитировано. Например, в криобанке Института физиологии растений РАН хранятся клетки моркови, которые находятся в жидком азоте около 20 лет, меристемы картофеля – более 10 лет и др.

Оттаивание и проверка жизнеспособности клеток после хранения в жидком азоте является последним этапом технологии криосохранения. Если замораживание осуществляют медленно, постепенно, то оттаивание должно быть проведено как можно быстрее. Для этого ампулы помещают в водяную баню с температурой 40°, а иногда и 60° С и выдерживают до полного исчезновения последнего кристаллика льда.

Для определения жизнеспособности клеток после оттаивания применяют наиболее простой, быстрый и вполне удовлетворительный способ – окраска витальным красителем (0,1%-ным феносафранином или 0,25%-ным раствором сини Эванса), в результате которой мертвые клетки окрашиваются, а живые нет. Окончательным критерием, безусловно, служит четкое возобновление роста и деления клеток при рекультивации на искусственных питательных средах после оттаивания.

Экспериментально было показано, что клетки после хранения в жидком азоте не теряют способности к делению, регенерации растений, не уменьшается продуктивность синтеза вторичных метаболитов (клетки продуценты) и т.д. Так, Институтом физиологии растений РАН совместно с НПО по картофелеводству разработаны методы криосохранения меристем четырех сортов картофеля и показана возможность из 20% хранящихся меристем регенерировать целые растения, которые при высадке в поле не отличались по всем признакам, включая темпы роста и продуктивность, от обычных пробирочных растений (С. Манжулин и др., 1982). Более подробно о технике криосохранения можно узнать из обзорных работ А. С. Попова.

Таким образом, технология, связанная с криосохранением растительных объектов, развивается и постоянно совершенствуется. Несомненно, эта технология имеет свое будущее, так как уже сегодня криобанки могут значительно облегчить работу селекционеров, предоставив им возможность широко использовать пул генов сортов, в том числе старой селекции и диких видов, а также исчезающих видов растений.



Множество писем по поводу возможности клонирования в квартирных условиях заставили меня написать эту статью.
Да, теоретически это возможно.
(Мы, конечно же, имеем для этого спецоборудование.)
Данная статья рассчитана на простых людей, не имеющих спецобразования,
поэтому писать буду простым языком, без применения специальных терминов.
Научных работников лабораторий по размножению in vitro прошу отнестись к ней лояльно.
Прежде всего, разберемся во всех плюсах и минусах микроклонального размножения.
Минусы:
Качественный процесс, если соблюдать все правила, - очень дорогое удовольствие.
Поэтому, выгодно это только в очень большом количестве - десятки тысяч и более.
Мало кто в нашей стране в это хочет вкладывать десятки тысяч долларов.
Именно поэтому, мы имеем дело часто с некачественным посадочным материалом. Растения плохо переносят адаптацию, химеры спортуют, и т.д. При размножении же традиционным способом, слабые растения просто погибают, а выживают сильнейшие.
Плюсы:
При соблюдении всех тонкостей, при микроклональном размножении можно получать любое количество одинаково очень качественного посадочного материала, что не возможно при традиционном размножении. В дальнейшем после адаптации, качественно клонированные растения опережают в своем развитии своих братьев, выращенных традиционным способом.
Если у Вас есть свободное время и желание попробовать, то я опишу первый, на мой взгляд, самый главный этап этого процесса. Клонировать будем фаленопсис. Так как питательная среда содержит все необходимое для размножения не только нужной для нас культуры, но и для всевозможных грибков, бактерий, летающих в воздухе и находящихся на самом растении, нужно пройти этап получения стерильной культуры.
Как только Вы получите стерильный, жизнеспособный материал, дальше множить его - дело техники.
Для начала, Вы должны найти подходящее помещение. Например, подойдет ванная комната, облицованная кафельной плиткой. Моете ее всю с применением дезинфицирующего средства. Предварительно покупаете в медтехнике кварцевую лампу 400вт.(50-100гривен), подключаете ее к обыкновенному дросселю(40-80грн.) Кварцуете комнату 2- 4 часа. Покупаете ватно-марлевую повязку, халат, шапочку. Проглаживаете все эти вещи и вешаете в комнате перед кварцеванием. Все вспомогательные вещи, кроме, конечно, растений, заносятся в комнату перед кварцеванием. Любая малейшая пылинка, попавшая в стерильную пробирку с питательной смесью, вырастет в большую плесень. Поэтому хочу обратить Ваше внимание на ответственность этого этапа. Естественно, нужно заклеить все вентиляционные отверстия. Далее Вам понадобятся пинцет, скальпель, стерильные салфетки (их должно быть не менее 10), на которых вы будете подрезать цветоносы. Пустые банки, фольга, инструменты стерилизуются в духовке при температуре не ниже 200 градусов 2 часа. В качестве салфеток подойдут льняные лоскутки размером 20 на 20 см. Заворачиваете в пищевую фольгу, все по отдельности, и прожигаете в духовке при температуре 150 градусов 3 часа (подберите сами максимальную температуру, чтобы они не сгорели).
Покупаете в аптеке дистиллированную воду, разливаете в предварительно стерилизованные в духовке 200 граммовые банки. Закрываете банки прожженной фольгой и стерилизуете, можно в духовке, скороварке, микроволновке (фольгу заменить бумагой). Далее готовите стерилизационный раствор. Подойдет обыкновенная хлорка. Разводите ее 10гр на 100 мл дистиллированной воды. Моете цветоносы в проточной воде с хозяйственным мылом.
Вот минимум предварительных работ.
Выключаете кварцевую лампу (обгореть можно за 10 минут), заходите в комнату, заносите цветоносы, переодеваетесь (надеваете халат, шапочку, ватно-марлевую повязку), протираете руки и стол, на котором будете работать, спиртом. Никаких резких движений.
Расставляете перед собой банку со стерилизующим раствором и три банки со стерилизованным дистиллятом. Опускаете цветоносы в первую банку. Вынимаете стерильным пинцетом первый цветонос через 6 минут, второй через 8 и т.д., последний через 20 минут. Опускаете сразу после первой банки в дистиллят. Вымачиваете цветоносы 10 минут. Пинцет и скальпель стерилизуете в пламени спиртовки и даете им остыть перед каждым последующем использованием. Опускаете цветоносы в следующую банку с дистиллятом. Затем, также в третью. Это необходимо для удаления остатков хлорки. Разворачиваете фольгу с салфетками и кладете на нее один цветонос. Обрезаете цветонос прожженным скальпелем. Оставляете внизу под спящей почкой 5мм., выше - 3 мм. Открываете пробирку с питательной смесью (покупаете у меня - 2 гривны штука), сажаете туда цветонос, чтобы спящие почки были над поверхностью, закрываете фольгой. И так далее с каждым цветоносом, меняя салфетки и стерилизуя инструменты. ВСЕ.
Ставите пробирки с цветоносами на полки. Температура 25-28 градусов. Продолжительность светового дня примерно 16 часов. Влажность 70%. Если в пробирках через две недели не поросло плесенью, то Вы достерилизовали. Если через месяц (максимум 1,5 месяца) почки не проснулись, то Вы перестерилизовали. Из спящих почек, при соблюдении температурного режима, вырастут несколько маленьких розеток, которые в дальнейшем Вы и будете клонировать.
Ну как, Вам еще хочется попробовать этим заняться?
Если Вы осилите этот этап, то следующие тем более.

Использование: сельское хозяйство и биотехнология. Сущность изобретения: питательная среда содержит минеральные соли и регуляторы роста, при этом в агаризованную питательную среду вводят дополнительно тетраметилтиурамсульфид (ТМТД) в количестве 25-100 мг/л или 25-100 мг/л ТМТД и 1-20 мг/л фундазола, или 25-100 мг/л ТМТД и 1-20 мг/л фундазола в сочетании с 2,5-50 мг/л метиленового синего и 1-10 мг/л бриллиантового зеленого, а в питательную среду с твердым носителем вводят дополнительно 20-100 мг/л ТМТД или 25-100 мг/л нистатина. 2 табл.

Изобретение относится к области сельского хозяйства и биотехнологии, в частности к способам микроклонального размножения растений и безвирусному семеноводству. Известен способ микроклонального размножения и выращивания растений in vitro путем посадки микрочеренков на питательную среду, содержащую элементы минерального питания по Мурасиге-Скугу и регуляторы роста. Недостатком указанного способа является частое "зарастание" питательной среды микроорганизмами-контаминантами при нарушении условий стерильности. Размножение микроорганизмов приводит к накоплению токсических веществ и вследствие этого гибели части растений и, следовательно, возрастанию затрат для получения необходимого их количества, и(или) для поддержания более высокого уровня стерильности. Цель изобретения - подавление роста микроорганизмов-контаминантов, упрощение способа и снижение затрат при выращивании растений in vitro. Предлагаемый способ выращивания растений in vitro заключается в следующем. Посадка микрочеренков в стерильных условиях производится на питательную среду, содержащую минеральные соли, сахарозу, агар-агар и регуляторы роста, в состав которой дополнительно вводят 25-100 мг/л тетраметилтиурамдисульфида (ТМТД) или ТМТД (25-100 мг/л) и фундазол в количестве 1-20 мг/л или ТМТД(25-100 мг/л) и фундазол (1-20 мг/л) в сочетании с метиленовым синим 2,5-50 мг/л и бриллиантовым зеленым - 1- 10 мг/л. Предлагаемый способ отличается от известного способа выращивания in vitro тем, что в состав питательной среды дополнительно вводят соединения, обладающие биоцидной активностью против наиболее часто встречающихся в практике микроразмножения растений видов микроорганизмов грибной и бактериальной природы: ТМТД или ТМТД в сочетании с фундазолом или ТМТД в сочетании с фундазолом, метиленовым синим и бриллиантовым зеленым. В результате применения данного способа гибель растений вследствие "зарастания" питательной среды микроорганизмами-контаминантами снижается в 2 и более раз. Соответственно снижаются затраты, необходимые для выращивания дополнительного числа растений. При поддержании коллекций сортов и форм in vitro иногда возникает ситуация "зарастания" всех пробирок данного сорта с угрозой его потери. В случае контаминации чувствительными микроорганизмами черенкование инфицированных растений на предложенную среду позволяет сохранить коллекционный образец. Посадка микрочеренков в стерильных или нестерильных условиях производится на стерилизованный прокаливанием перлитовый песок, пропитанный жидкой минеральной питательной средой без органических добавок, в состав которой дополнительно вводят 20-100 мг/л тетраметилтиурамдисульфида (ТМТД) или 25-100 мг/л нистатина. Применение компонентов с альгицидной активностью - ТМТД или нистатина - устраняет зарастание микроводорослями, выделяющими токсичные для растений соединения, при выращивании в нестерильных условиях или при случайном нарушении стерильности. Это позволяет также последнее микрочеренкование перед высадкой в теплицу проводить в нестерильных условиях, что позволяет упростить способ выращивания за счет более удобных манипуляций с черенками в нестерильных условиях и уменьшить необходимые площади по сравнению с пробирочной культурой. Пример 1. Биоцидные компоненты в указанных табл. 1 и 2 концентрациях были добавлены к питательной среде для микрочеренкования, содержащей минеральные соли по Мурасиге-Скугу и регуляторы роста, а также 7 г/л агар-агара и 20 г/л сахарозы, перед ее стерилизацией автоклавированием (120 o C, 20 мин). Черенки растений картофеля, поддерживавшихся in vitro в стерильной культуре, с одним-двумя междоузлиями высаживали в пробирки с питательной средой и выращивали 3-4 нед при температуре 20 o C и освещенности 5000 лк. Учитывали число случайных зарастаний грибной и бактериальной инфекцией. Как видно из табл. 1, суммарное зарастание контаминантами грибной природы снижается в два и более раз при введении в состав среды ТМТД и фундазола. При этом зарастание Penicillium sp. подавляется полностью (в контроле 1.3%), а рост бактерий изменяется незначительно (табл. 2). Введение в состав среды метиленового синего и бриллиантового зеленого является эффективным в качестве антибактериального средства (табл. 2). Пример 2. Черенки растений картофеля, поддерживавшихся in vitro в стерильной культуре, с одним-двумя междоузлиями нестерильно высаживали на перлитовый субстрат, стерилизованный прокаливанием 2 ч при 170 o C и помещенный в чашки Петри, пропитанный питательной средой, содержащей раствор Кноппа или минеральные соли по Мурасиге-Скугу с добавлением регуляторов роста, а также биоцидных компонентов: 25 мг/л ТМТД или 25 мг/л нистатина. По мере подсыхания субстрата проводили полив дистиллированной водой (примерно, 1 раз в неделю). Через две недели в контрольном варианте (без добавления ТМТД или нистатина) отмечено зарастание микроводорослями, в вариантах с добавлением ТМТД и нистатина зарастание отсутствует, вес надземной части растения составляет 100-180% от контроля. Через 1 мес после посадки в контрольном варианте отмечено бурное развитие микроводорослей на поверхности перлита, растения угнетены, отдельные растения погибли, в опытных вариантах небольшой рост водорослей в местах полива, развитие растений нормальное.

Формула изобретения

Способ выращивания растений in vitro, включающий микрочеренкование и посадку микрочеренков на питательную среду, содержащую минеральные соли и регуляторы роста, отличающийся тем, что посадку микрочеренков осуществляют на агаризованную питательную среду с сахарозой или на питательную среду с твердым носителем, в качестве которого используют перлит, при этом в агаризованную питательную среду вводят дополнительно ТМТД в количестве 25 100 мг/л, или 25 100 мг/л ТМТД и 1 20 мг/л фундазола, или 25 100 мг/л ТМТД и 1 20 мг/л фундазола в сочетании с 2,5 50,0 мг/л метиленового синего и 1 10 мг/л бриллиантового зеленого, а в питательную среду с твердым носителем вводят дополнительно 20 100 мг/л ТМТД или 25 100 мг/л нистатина.

Похожие патенты:

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при диагностике гепатита В

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, в частности, к получению штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела, которые могут быть использованы для приготовления высокоспецифических диагностических реагентов с целью идентификации и количественного определения уровня иммуноглобулинов G класса в биологических жидкостях организма свиньи

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии, а именно к способу выращивания растений in vitro. Способ состоит в том, что приготавливают питательную среду для укоренения, в качестве которой используют питательную среду по Мурасиге и Скугу, разбавленную вдвое по минеральным и органическим компонентам. В указанную среду добавляют оксибензойную кислоту в концентрации 110 -5 - l10 -4 M. Объем раствора доводят до 1 л, устанавливают pH 5,5 - 5,7 и при нагревании растворяют навеску агар-агара. Питательную среду разливают по сосудам и автоклавируют при давлении 1 атм (температура 120°С) в течение 15 - 20 мин, после чего осуществляют высадку на нее побегов. Через 30 дней культивирования на питательной среде укоренения пробирочные растения высаживают в нестерильные условия. При этом растения извлекают из сосудов и обрабатывают борной кислотой в концентрации 1,510 -4 - 1,510 -3 М. Способ позволяет увеличить приживаемость растений при пересадке в нестерильные условия на 13,3 - 49,0% по сравнению с известным способом адаптации. Технический результат достигается тем, что последовательно воздействуют оксибензойной кислотой на этапе укоренения побегов, а затем борной кислотой перед пересадкой растений в нестерильные условия. 2 табл.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии и может быть использовано в процессе укоренения и адаптации различных культур. Известен способ выращивания растений in vitro, при котором в питательную среду для укоренения с целью улучшения ризогенеза вводят регулятор роста ауксиновой природы, причем в качестве последнего чаще всего используют индолилмасляную кислоту /авт.св. СССР N 1792270, кл. A 01 H 4/00, 29.04.91. Пивень Н. М., Мельничук Г.Г., Фелалиев А.С. Способ укоренения побегов орехоплодных, полученных in vitro. Бюл. N 4 от 30.01.93/. Однако при таком способе на начальном этапе укоренения часто наблюдается усиление недифференцированного роста тканей, ингибирование процессов формирования и роста корней, что приводит к ухудшению укореняемости и удлинению периода укоренения растений. Поэтому для улучшения укореняемости применяют различные приемы, например, замачивают микрочеренки в растворе регулятора роста /ИМК/ над поверхностью агаризованной среды /патент РФ N2060646 кл. A 01 H 4/00, 1994 г. Туровская Н. И., Пронина И.Н., Матушкина О.В. Способ укоренения побегов плодовых культур, полученных in vitro. Бюл. N 15 от 27.05.96/. Вместе с тем данный способ весьма трудоемок, требует дополнительных затрат времени на приготовление среды и создает опасность контаминации среды вредной микрофлорой. Критическим этапом для растений, выращенных на питательных средах, является их адаптация к нестерильным условиям. При этом иногда погибает более 50% высаженных растений. Для улучшения приживаемости растения намачивают в воде /авт.св. СССР N 1720597, кл. A 01 H 5/00, 26.12.89. Упадышев М.Т., Высоцкий В. А. Способ подготовки растений - регенерантов к посадке в нестерильные условия. Бюл. N 11 от 23.03.92/. Однако намачивание в воде не на всех культурах приводит к положительным результатам. К тому же в условиях повышенной влажности воздуха и субстрата для адаптации создаются предпосылки поражения растений грибной инфекцией. Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является способ адаптации растений к нестерильным условиям, при котором растения с целью улучшения приживаемости обрабатывают 1%-ным раствором марганцевокислого калия, а затем раствором индолилуксусной кислоты /патент N 1792269 кл. A 01 H 4/00, 03.01.90. Дорошенко Н.Н., Кострикин И.А. Способ адаптации растений к нестерильным условиям. Бюл. N 4 от 30.01.93/. Недостатками этого способа являются многооперационность, трудоемкость, а также то, что он апробирован только на растениях винограда. Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является увеличение укореняемости побегов, улучшение развития корневой системы различных растений, увеличение приживаемости пробирочных растений при пересадке в нестерильные условия, ускорение и упрощение процесса выращивания. Поставленная задача решается тем, что в способе выращивания растений in vitro, включающем приготовление питательной среды, высадку на нее побегов растений и их культивирование, на этапе укоренения растений в питательную среду дополнительно вводят оксибензойную кислоту в концентрации 110 -5 -110 -4 М. Кроме того, задача решается и тем, что на этапе пересадки в нестерильные условия растения обрабатывают антисептиком, в качестве которого используют борную кислоту в концентрации 1,510 -4 -1,510 -3 М. Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что растения на этапе адаптации обрабатывают в качестве антисептика борной кислотой, причем предварительно растения культивируют на среде укоренения с добавлением оксибензойной кислоты. Это позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию "новизна". Предложенное техническое решение обладает изобретательским уровнем, так как предложенный способ выращивания совершенно неочевиден для специалистов, работающих в области культуры ткани, и ранее не был использован для этих целей, то есть предложен впервые. Применение предлагаемого способа позволяет получить новый эффект - увеличить укореняемость побегов, улучшить развитие корневой системы растений, повысить их приживаемость в нестерильных условиях. Химические препараты, необходимые для осуществления предложенного способа выращивания, характеризуются низкой стоимостью и производятся промышленностью, поэтому изобретение вполне может быть реализовано в условиях учреждений, работающих в области культуры тканей и органов растений. При этом не требуется разработки специального оборудования. Пример 1. Приготавливают питательную среду для укоренения. Для этого берут питательную среду по Мурасиге и Скугу /1962/, разбавленную вдвое по минеральным и органическим компонентам, мг/л: аммоний азотнокислый - 825, калий азотнокислый - 950, кальций хлористый - 220, магний сернокислый - 185, калий фосфорнокислый - 85, железо сернокислое - 13,6, этилендиаминотетраацетат натрия - 18,7, борная кислота - 3,1, марганец сернокислый - 11,2, цинк сернокислый - 4,3, калий йодистый - 0,42, натрий молибденовокислый - 0,13, медь сернокислая - 0,013, кобальт хлористый - 0,013, миоинозит - 50,0, тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота - по 0,25, аскорбиновая кислота - 0,5, индолилмасляная кислота - 1,0, сахароза - 15000, агар - агар - 7000, остальное - вода до 1 л. В указанную среду добавляют оксибензойную кислоту в концентрации 110 -5 М. Объем раствора доводят до 1 л, устанавливают pH 5,5-5,7 и при нагревании растворяют навеску агар-агара. Питательную среду разливают по сосудам и автоклавируют при давлении 1 атм /температура 120 o C/ в течение 15 - 20 мин, после чего осуществляют высадку побегов. Как показали результаты /табл.1/, при разработанном способе отмечается увеличение укореняемости в зависимости от вида растения на 7 - 15%, числа корней в 1,2 - 2,8 раза, длины корней в 1,7 - 3,2 раза по сравнению с прототипом. Пример 2. Способ осуществляют по примеру 1. В питательную среду вводят оксибензойную кислоту в концентрации 5,010 -5 М>. Как видно из таблицы 1, применение разработанного способа выращивания позволяет увеличить укореняемость побегов в среднем на 20 - 27%, числа корней - в 2,1 - 2,9 раза, а их длины - в 1,8 - 5,6 раза по сравнению с известным способом. Пример 3. Способ осуществляют по примеру 1, в питательную среду вводят оксибензойную кислоту в концентрации 1,010 -4 М. Предложенный способ обеспечивает увеличение укореняемости побегов на 15 - 67%, числа корней - в 2,1 - 3,3 раза, длины корней - в 2,1 - 5,0 раз в сравнении с прототипом /табл. 1/. Следует отметить и такой положительный эффект выращивания растений по предложенному способу, как снижение диаметра каллуса в среднем в 1,6 раза по сравнению с известным способом. Это особенно важно для такой культуры, как груша, поскольку на среде с одной индолилмасляной кислотой она формирует в основании побега очень большой каллус, что отрицательно сказывается и на укоренении, и на развитии корневой системы. Более низкие концентрации оксибензойной кислоты /0,510 -5 М/ или более высокие концентрации /2,010 -4 М/ ухудшали развитие растений по сравнению с предложенным диапазоном концентраций, а следовательно, были менее эффективными /табл. 1/. Пример 4. Пробирочные растения через 30 дней культивирования на питательной среде укоренения высаживают в нестерильные условия. При этом растения извлекают из сосудов и обрабатывают борной кислотой в концентрации 1,510 -4 -1,510 -3 М. Приживаемость растений, обработанных борной кислотой, возрастает на 25,9-49,0% для груши, 14,3-35,7% для ежевики, 13,3-20,0% для малины черной, 16,7-40,0% для малино-ежевичного гибрида и на 10% для жимолости по сравнению с известным способом адаптации /табл. 2/. Часто наряду с увеличением приживаемости улучшается развитие корневой и надземной систем растений, увеличивается число листьев. Полученные результаты свидетельствуют о достижении значительного технического эффекта в сравнении с известным способом выращивания. Применение оксибензойной кислоты на этапе укоренения позволяет в среднем увеличить процент укоренения в 1,5 раза, число корней - в 2,3 раза, длину корней - в 3,3 раза. Благодаря более раннему укоренению растения становятся пригодными к высадке в нестерильные условия на 7 - 14 дней раньше, а следовательно, и ускоряется технологический цикл выращивания. Обработка растений борной кислотой на этапе адаптации к нестерильным условиям способствует увеличению приживаемости растений в среднем на 24% по сравнению с известным способом. В лучших вариантах число корней возрастало в 2 раза, их длина - в 5,6 раза, приживаемость в нестерильных условиях - в 4,4 раза. Выход готовых растений в среднем увеличивался в 1,9 раза по сравнению с известным способом выращивания.

Формула изобретения

Способ выращивания растений in vitro, включающий приготовление питательной среды, содержащей оксибензойную кислоту, высадку на нее побегов растений и их культивирование для укоренения с последующей пересадкой растений в нестерильные условия, отличающийся тем, что перед пересадкой в нестерильные условия их обрабатывают борной кислотой в концентрации 1,5 10 -4 - 1,5 10 -3 М.

Виды посадочного материала

Для закладки коммерческих насаждений голубики используют одно-, двух- или трехлетние саженцы с закрытой корневой системой.

Фото с питомника Driesvenplant (Нидерланды): Стандартные 2-летние саженцы голубики для закладки коммерческой плантации

Стандартный двухлетний саженец обычно дает первый урожай на следующий год после посадки. В год посадки на растении удаляют цветки, что стимулирует активный вегетативный рост. Часто, частичное или полное удаление цветков практикуют и на второй год после посадки таким образом откладывая плодоношения еще на сезон. Такой подход дает возможность сформировать более продуктивное растение с большой вегетативной массой и достаточным количеством плодовых почек.
Порой, производители используют однолетние саженцы, которые, перед высадкой на плантацию, дорощуються один сезон в хозяйстве. Таким образом можно несколько снизить затраты на посадочный материал (учитывая дополнительные затраты на доращивание в питомнике и определенный процент гибели саженцев) и существенно сократить стоимость транспортировки (так, в один рефрижератор емкостью 86 м 3 помещается всего 10 - 12 000 двухлетних саженцев, или около 30 000 однолетних).

Фото с питомника FallCreek (США) Однолетние саженцы голубники для дальнейшего доращивания посадочного материала

Посадочный материал голубики могут быть выращеные с использованием технологии in-vitro, или традиционными методами (черенкованием зелеными или одревесневшими черенками).
Некоторые производители предпочитают саженцы, выращенные традиционными методами (из-за проблем, которые возникали в прошлом с использованием in-vitro материала - при использовании неправильных концентраций регуляторов роста in-vitro саженец может иметь высокую силу вегетативного роста, однако ограниченную производительность).
В последнее время современные лаборатории in-vitro значительно усовершенствовали технологии выращивания посадочного материала и могут предложить качественные производительные саженцы в практически неограниченных количествах.

Фото с питомника FallCreek (США). Кассетный саженец голубики, выращенный in-vitro

Одно из преимуществ саженцев in-vitro - большое количество побегов замещения в первые 5-8 лет жизни растения. Это позволяет сформировать высокопроизводительный куст.

Фото с плантации в Орегоне, США: формирование большого количества побегов замещения в весенний период

Технология выращивания саженцев

Основные методы выращивания посадочного материала голубики в коммерческом производстве - укоренения одревесневших или зеленых черенков и размножение с использованием технологий in-vitro.
Чернику можно выращивать из семян, прививкой, и другими методами, однако такие подходы практикуются в основном селекционными и исследовательскими учреждениями и имеют ограниченное использование в коммерческом производстве.
Черенки для размножения заготавливают с маточных растений, которые выращивают на высоком агрофоне с регулярными обработками средствами защиты. При заготовке черенков с плодоносной плантации сначала необходимо отобрать растения, отвечающие всем признакам того или иного сорта, которые не имеют проявления заболеваний, повреждений вредителями или дефицита элементов питания. Если планируется заготовить одревесневшие черенки - выбор растений, из которых они будут нарезатся желательно сделать в течение сезона вегетации.
Большинство сортов, выведенных в последнее время, защищены авторским правом. Посадочный материал таких сортов, как для продажи, так и для использования в пределах хозяйства, можно выращивать только при наличии лицензии и при условии уплаты роялти за каждый выращенный саженец.
Например, к таким сортам относятся новейшие сорта высокорослой голубики выведены в Мичиганском Государственном Университете - Дрейпер (Draper ®), Либерти (Liberty ®) и Аврора (Aurora ®).

Размножение одревесневшими черенками. Наиболее распространенный метод размножения голубики - это укоренение здеревянилих черенков. Этот метод не требует значительных инвестиций в оборудование и для большинства сортов, дает удовлетворительный результат.
Черенки заготавливают с однолетних приростов длиной 30-50 см осенью после опадения листьев или в зимне-весенний период, после того, как растение находилось в периоде покоя как минимум 6-8 недель (при температуре ниже 7 о С).
Черенки нарезают с растений, которые не имеют видимых симптомов болезней или дефицита элементов питания, они должны быть хорошо вызревшимы (желательно выбраковывать побеги последней волны роста, которые полностью не созрели). Также отбраковывают часть побега, которая содержыт генеративные почки - формирование таких почек перераспределяет концентрацию регуляторов роста и такие черенки практически не укореняются (удаление генеративных почек вручную не улучшит укоренения черенка).
Желательно, чтобы черенки были толщиной не более 4-6 мм и длиной 8-10 см (3-4 почки). Верхний срез делают прямым над верхней почкой, нижний - скошенным под нижней. Срезы желательно делать острым ножом (чтобы поверхность среза оставалась ровной).
Черенки связывают в пучки, следя, чтобы они были ориентированы в одинаковом направлении. Если возникает необходимость временного хранения черенков (до 1 недели) - пучки укладывают в ящики с влажным торфом или опилками и держат при температуре +2...+4 о С. При необходимости более длительного хранения (до 3-х недель) пучки желательно обработать фунгицидом и упаковаты в полиэтиленовую пленку.
Для укоренения используют субстрат, состоящий из верхового нерозкисленого торфа, песка и перлита (для большинства сортов удовлетворительные результаты можно получить при использовании торфа и перлита в пропорции 50:50, однако некоторые - например Блукроп, лучше укореняется в чистом торфе).
Для высадки черенков используют пленочные или стеклянные парники с 50% притенением и хорошим дренажем. Слой субстрата должен быть не менее 10 см (нижняя часть черенка не должна прикасаться к основанию парника). Можно использовать парник с электроподогревом основы - для укоренения чернков температуру основания поддерживают на уровне 21 о С.
Как минимум за неделю до высадки субстрат хорошо увлажняют.
Черенки высаживают когда минует угроза сильных заморозков, их размещают вертикально, по схеме 5х5 см, только с одной верхней почкой с наружи. Сразу после высадки субстрат поливают, чтобы он осел и более плотно прилегал к черенкам. Через несколько недель после высадки почка просыпается и начинает развиваться побег, однако корневая система формируется лишь через 12-14 недель.
При наступлении теплой погоды рамы парника немного приоткрывают в дневные часы - при этом необходимо следить за влажностью субстрата. При необходимости поливы проводят утром, до наступления жаркой погоды.
Повышенная концентрация солей существенно ухудшает укоренение, поэтому подкармливать саженцы начинают только при сформированной корневой системе. Для стимулирования роста можно использовать сульфат аммония в концентрации 10 г на литр воды (на квадратный метр парника), сразу после подкормки растения остатки удобрения с листвы обязательно смывают чистой водой.
После формирования корневой системы растения закаляют в течение нескольких недель, частично открывая парник в дневные часы. После закалки пленку снимают, однако оставляют притеняющий материал.
Для зимовки молодые растения можно оставить в парнике или выкопать, упаковать в пленку (или ящики с влажными опилками) и хранить в холодильнике при температуре 0...+4 о С.

Размножение зелеными черенками. Черенки для зеленого черенкования заготавливают в начале лета сразу после затухания первой волны роста. Можно использовать черенки со второй или третьей волны роста, однако по данным исследований процент их укоренения несколько ниже. Черенки нарезают длиной около 10 см и удаляют нижние листья, оставляя только два верхних. Как и при подготовке одревесневших черенков, важно, чтобы срез был как можно ровнее, поэтому лучше использовать острый нож или садовые ножницы (но не секатор). Сразу после нарезки черенки увлажняют и заворачивают во влажную мешковину. Желательно использовать как маточный материал черенки с молодых растений, которые лучше укореняются.
Для улучшения укоренения можно использовать регуляторы роста путем погружения нижней части черенка в тальк с индолил-масляной кислотой (коммерческие препараты RhizoponAA или Hormodine) или спиртовый раствор смеси индолил-масляной и индолил-уксусной кислоты (Dipand Grow).
Субстрат для укоренения должен быть достаточно пористый, содержать достаточное количество воды, однако обеспечивать хороший дренаж при переувлажнении. В качестве субстрата используют чистый верховой торф, измельченную кору сосновых пород, или смесь этих материалов с перлитом или песком.
При размножении зелеными черенками очень важно поддерживать листву не укорененных черенков увлажненной в течение дня. С этой целью используют систему туманообразования с дневным/ночным таймером, включается на 5-10 секунд каждые 10 минут. Периодичнись и продолжительность поливов зависит от скорости высыхания листа (в жаркие солнечные дни - чаще, в облачные прохладные - реже). Поэтому настройки контроллера необходимо менять в зависимости от условий, или использовать датчик увлажненности листа, который при пересыхании автоматически подает сигнал на включение системы.
Примерно через 2-3 недели после высадки образуется каллус и черенок начинает укореняться. С этого момента желательно уменьшить частоту и продолжительность поливов и постепенно снимать притенение. После образования корневой системы растения можно подкармливать слабым раствором минеральных удобрений (как одревесневшие укорененные черенки).
Осенью или следующей весной растения пересаживают в большие емкости (1,5-3,0 л) для дальнейшего доращивания перед высадкой в ​​поле.

Размножение голубики in-vitro. С использованием данных исследований: Anderson 1975, Anderson 1978, Billings et al. 1988, Kyte and Briggs 1979, McCullouch and Briggs 1982, Nickerson 1978, Preece and Sutter 1991, Zimmerman and Broome 1980.
На протяжении последних десятилетий технология выращивания посадочного материала голубики путем in-vitro существенно улучшилась и на современном этапе позволяет в короткие сроки вырастить практически неограниченное количество качественного однотипного посадочного материала, свободного от вирусов, возбудителей болезней и вредителей.
В качестве эксплантов отбирают черенок с одним междоузлием из молодого побега в активной фазе роста. С черенка удаляют листья следя, чтобы не повредить почку, и промывают водой с добавлением моющего средства.
Затем эксплант промывают в 0,1% растворе детергента в стерильной дистиллированной воде (Полисорбат 20 коммерческое название Tween 20) в течение 5 мин и погружают в 70% этиловый спирт на 30 секунд. После обработки эксплант трижды промывают в стерильной дистиллированной воде и погружают в стерильный раствор антиоксиданта (смесь лимонной и аскорбиновой кислоты 1/1), после чего снова промывают в стерильной воде в течение 2 мин.
Эксплант обрезают, чтобы верхний и нижний срез находился по крайней мере в 5 мм от почки и помещают в стерильный агар.
После 4 недель выращивания удлиненные побеги (около 4 см) материал пересаживают на свежий агар, выдерживают еще 4 недели и продолжают размножения используя культуру листьев: листочки удаляют из растения, нацарапывают скальпелем и размещают на свежий агар - новые побеги образуются по периметру листа в местах царапин.
Материал пересаживают каждые 2-4 недели - при последней пересадке перед выводом культуры с in-vitro в агар перестают добавлять цитокинины для стимулирования удлинения побегов.
Для пересадки используют побеги длиной 2-3 см, их укореняют в смеси торфа, перлита и вермикулита (1/1/1).
Среда: используют стандартную среду Мурасиге-Скугу (MS) половинной концентрации с добавлением витаминов , цитокинин 6 (α, α-диметилалиламин)-пурин (2iP), сахарозу и Агар.
Освещение: 2150 - 4300 лм/м 2 , тепло- и холодно-белые флуоресцентные лампы, 16 часов освещения / 8 часов темноты.
Температурный режим: 24 ... 26 о С.
Среда для растений рода Vaccinium, мг/л